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L’espansione della città ben oltre il limite delle antiche mura serviane e il timore di invasioni delle popolazioni germaniche che premevano ai confini dell’Impero indussero l’imperatore Aureliano alla costruzione di una nuova cinta muraria. I lavori, iniziati nel 271 e condotti abbastanza rapidamente, furono portati a termine da Probo (276-282 d.C.). Le mura, in mattoni, hanno una lunghezza complessiva di circa 19 chilometri e sono dotate di una torre quadrata ogni trenta metri (cento piedi romani). L’altezza è di circa 6 metri, lo spessore di 3,5 metri. Le porte più importanti presentavano due ingressi ad arco, con paramento in travertino, inquadrati da due torri semicircolari; altre porte avevano un arco semplice mentre quelle più modeste erano semplicemente inserite tra le torri quadrate di un tratto di mura. La fretta con cui si costruì il sistema difensivo fece inglobare nella cinta muraria anche alcuni edifici di grandi dimensioni, come l’accampamento dei Pretoriani, l’anfiteatro Castrense, la Piramide Cestia, il muro di recinzione dei giardini degli Acilii (il "Muro Torto") e alcuni tratti di acquedotti.

Le mura furono rinforzate più volte; negli anni 401-402, sotto Onorio e Arcadio, ne fu raddoppiata l’altezza e il precedente cammino di ronda venne sostituito da corridoi coperti; al di sopra fu creato un nuovo camminamento scoperto dotato di merli, dove erano le macchine da guerra. Anche gli ingressi doppi di alcune porte furono ridotti ad uno solo, e le loro torri rialzate e rinforzate, come nelle porte Appia (ora chiamata S. Sebastiano) e Flaminia. Alcune divennero vere e proprie fortezze autosufficienti, con una controporta interna collegata da due muri a tenaglia alle mura principali, come si può vedere nell’unico esempio ancora conservato di Porta Ostiense, in cui la controporta risale all’epoca di Massenzio. Ulteriori restauri alle mura si ebbero nel VI secolo ad opera di Belisario, nel corso delle guerre gotiche.